Borgio, FrancisAbdulAzeez, SayedSonbol, Bayan Sameer Mohammed2023-08-112023-08-112022https://hdl.handle.net/20.500.14154/68851Various factors can increase the risk of fetal genetic abnormalities during pregnancy, such as maternal age and family history. Prenatal diagnosis is a critical clinical practice for couples at risk of genetic disorders in the fetus. The study aims to identify pathogenic gene variations in the early stage of fetal development using invasive and non-invasive prenatal samples by developing fetal cell isolation, gender determination, and gene variation screening. Different samples were collected from various sources, maternal blood (n=10), serum (n=8), paternal blood (n=7), maternal buccal swab (n=8), maternal urine (n=9), and amniotic fluid (n=6). Coelomic fluid (n=1) was also collected for the first time in the history of Saudi Arabia. Different methods were used for fetal cell isolation: morphology based using a designed manual micromanipulator from invasive samples; Cluster of differentiation 71 (CD71) microbeads mediated magnetic cell sorting and percoll based subfractionation for fetal nucleated red blood cells (fNRBCs) from invasive and non-invasive samples. In-house multiplex gender PCR was used for the fetus gender determination. Nested and Amplification refractory mutation system (ARMS) PCR with newly designed primers carried out for detecting sickle cell disease (SCD) mutation (HBB:c.20A>T) in the isolated fetal cells. Our study has successfully identified a heterozygous sickle mutation in HBB gene from amniotic fluid cells and fetal DNA sample (n=3) using ARMS PCR. The study has also determined the fetal gender in single cell and fetal DNA using the gender PCR multiplex. All fetal DNA of fetal cells had a high accuracy than cell free fetal DNA (cffDNA). This study highlights that single-cell isolation from amniotic fluid and coelomic fluid could be used for accurate genetic screening for early diagnosis upon largescale validation.عوامل مختلفة تزيد من خطر الاعتلالات الجينية في الجنين خلال فترة الحمل مثل عمر الام وتاريخ العائلة. يعتبر الكشف عن الاعتلالات الوراثية ماقبل الولادة إجراء طبي أساسي للأزواج المعرضين لخطر الإصابة باضطراب وراثي في الجنين. تهدف الدراسة إلى تحديد الطفرة الجينية في المرحلة المبكرة من نمو الجنين باستخدام عينات ما قبل الولادة الجراحية وغير الجراحية من خلال تطوير طريقة لعزل خلايا الجنين وتحديد الجنس وفحص التباين الجيني. يشمل جمع العينات من دم الأم (عدد=١٠) مصل (عدد=٨)، دم الأب (عدد=٧)، مسحة الشدق للأم (عدد = ٨)، بول الأم (عدد= ٩)، السائل الأمنيوسي (عدد= ٦). ولأول مرة في تاريخ المملكة العربية السعودية تم الحصول على عينة واحدة من السائل السيلومي. تم استخدام طرق مختلفة لعزل الخلايا الجنينية، بما في ذلك عزل الخلايا بناءً على شكل الخلايا باستخدام معالج يدوي في العينات الجراحية، عزل خلايا الدم الحمراء ذات الأنوية بناء على وجود البروتين السطحي CD71 باستخدام الميكروبيدات ومحاليل تدرج الكثافة. تم استخدام تفاعل إنزيم البلمرة التسلسلي للكشف عن جنس الجنين. كما استخدم تفاعل إنزيم البلمرة التسلسلي من النوعين Nested and ARMS وبادئات صممت خصيصًا للكشف عن طفرة مرض الدم المنجلي (HBB:c.20A>T) . نجحت الدراسة في تحديد طفرة جينية لمغاير الزايجوت في جين الهيموغلوبين بيتا من خلايا و الحمض النووي السائل الامنيوسي للجنين(عدد٣). كما نجحت الدراسة في تحديد جنس الجنين عن طريق استخدام تفاعل إنزيم البلمرة متعدد التسلسل من خلية الجنين والحمض النووي الجنيني. تحديد جنس الجنين من الحمض النووي الجنيني الخلوي أكثر دقة من الحمض النووي الجنيني الغير خلوي. تسلط الدراسة الضوء على أنه يمكن استخدام طريقة الخلية الواحدة من السائل الأمنيوسي والسائل السيلومي لإجراء فحص جيني دقيق لأغراض التشخيص المبكر، وتطبيقها على مستوى أوسع.enGeneticBiotechnologyPregnancyThesis