Development of a Colorimetric SARS-CoV-2 Detection Technology Using Reverse-Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay

Abstract

The ongoing COVID-19 remains to spread worldwide, causing new cases and deaths daily since its declaration as a pandemic over two years ago. Diagnostic tests are the first line of defense against the transmission of this disease, with the reverse-transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) being the approved gold standard. However, due to the global demand for facilities, reagents, and healthcare workers needed for rapid population-based testing, alternative tests need to be invested. The most common limitation in using RT-qPCR is giving false diagnoses, which puts others at risk of infection. Efficient fighting against this pandemic correlates with easy and large-scale accessibility of detection tools. Therefore, we developed a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay to diagnose COVID-19 by targeting and amplifying the SARS-CoV-2 E gene. The reaction takes place isothermally in a water bath set at 65 °C, and the positive results are read out with the naked eye via a color change from red to yellow, without requiring expensive and bulky instruments. In addition, a fluorometric RT-LAMP assay was developed to validate the results. Both colorimetric and fluorometric assays performed superbly when testing 150 clinical specimens, yielding 89.5% and 100% sensitivities, respectively. Optimizing the originally designed primer set (E-ID1) successfully detected SARS-CoV-2 in 20 minutes with a limit of detection of 500 copies/reaction, corresponding to 20 copies/µL, with no cross-reactivity observed among other respiratory viruses. No misamplification was evident after prolonged reaction times, which eliminates the most common limitation of potential false-positive diagnoses. Furthermore, we used a color sensor to demonstrate that the RGB codes gradually increase with the color change in positive RT-LAMP reactions, providing a simple alternative monitoring technique. Lyophilization of the colorimetric RT-LAMP reagents showed promising results to develop in-home and easy-to-store testing kit. These findings are essential to support the use of this technique in healthcare systems in fighting the COVID-19 pandemic, especially in resource-limited areas.لا يزال مرض كورونا مستمر في الإنتشار و التسبب في حالات وفيات يومياً في جميع أنحاء العالم منذ إعلانه كجائحة منذ أكثر من سنتين. الفحوص التشخيصية هي خط الدفاع الأول ضد انتقال هذا المرض بين الأفراد، مع اعتبار النسخ العكسي لتفاعل البلمرة المتسلسلة (RT-qPCR) المعيار الذهبي المعتمد لإظهار دقة و تمييز عاليين في اكتشاف الفايروس. لكن نظراً للطلب العالمي على المرافق، أجهزة الكشف، و العاملين في مجال الرعاية الصحية اللازمين للفحص السكاني السريع و الموسع، يجب الإستثمار في الاختبارات البديلة. حيث أن القيد الأكثر شيوعاً في استخدام فحص البلمرة المتسلسلة هو إعطاء تشخيص خاطئ، مما يعرض الآخرين لخطر الإصابة. ترتبط فعالية مكافحة هذا الوباء ارتباطاً وثيقاً بإمكانية الوصول السهل و الواسع النطاق لأدوات الفحص. لذلك، قمنا بتطوير عدة اختبارات تستخدم منهجية النسخ العكسي و التضخم الحلقي متساوي الحرارة (RT-LAMP) لتشخيص مرض كورونا من خلال استهداف و تضخيم الجينE لفايروس كورونا. يتم التفاعل في ظروف متساوية الحرارة داخل حمام مائي مسخن الى 65 درجة مئوية، و يتم قراءة التشخيص الإيجابي بالعين المجردة عن طريق تغير اللون من الأحمر إلى الأصفر، دون الحاجة إلى أي معدات معقدة و مكلفة. أيضا، تم تطوير عدة فحوص فلورومترية تستخدم منهجية RT-LAMP للتحقق من صحة النتائج. كلا العدتين أدت التفاعل بشكل ممتاز عند استخدامهما لفحص 150 عينة إكلينيكية، حيث كانت حساسية الفحص اللوني 89.5% و الفحص الفلورومتري 100%. و قد نجح تحسين أداء بادئات التفاعل المبتكرة (E-ID1) في تشخيص الفيروس خلال 20 دقيقة بحد كشف 500 نسخة/تفاعل، ما يعادل 20 نسخة/مايكرو ليتر، دون وجود أي تفاعل متبادل مع الفيروسات التنفسية الأخرى. لم يكن هناك تشخيص إيجابي خاطئ حتى بعد استمرار التفاعل لفترة طويلة الامر الذي يعد حلا جذريا لمشكلة العلاقة الإيجابية بين الزمن و درجة التضخيم. إلى جانب ذلك، قمنا بإستخدام جهاز استشعار الألوان لإظهار أن قيم RGB تزداد تدريجياً مع تغير اللون في التفاعلات الإيجابية، مما يوفر طريقة بسيطة بديلة لمراقبة النتائج. تجفيف كواشف الفحص اللوني أظهر نتائج واعدة لتطوير عدة فحص منزلية سهلة التخزين. هذه النتائج تدعم استخدام التقنية في تشخيص مرض كورونا، لاسيما في المناطق محدودة الموارد.