Comparing the Effect of Two Pyrimidine Analogues on Colorectal Cancer Cells

Abstract

Nowadays, people are living in an era with high standards of healthcare accessibility, which can remarkably improve the diagnostic tools and the treatment plans of different diseases. These standards contribute to the determination of the general life expectancy in many parts of the world. With cancer, however, the mortality rate has globally increased by almost 40% over the past four decades, and it is expected that the mortality will further increase to reach 60% in the current decade with an estimated death of 13 million cancer patients by the year 2030. Colorectal cancer (CRC) is considered the third most frequent type of cancer and the second leading cause of cancer-related deaths, for both sexes, in the world. The explanation of the increased mortality of colorectal cancer might be due to some environmental factors, such as; smoking, bad diet, obesity, and very low physical activity, in addition to genetic background. The major pathways of either environmental (epigenetic) or genetic causes of CRC include CpG hypermethylation and microsatellite instability (MSI) due to the mismatch repair (MMR) gene deficiency. Considering that CRC accounts for 10% of the most commonly diagnosed types of cancer, there is an urgent need for developing effective treatment plans for CRC patients. 5-Azacytidine (5-AZA), a cytidine pyrimidine nucleoside analogue, is an epigenetic drug that incorporates into DNA and blocks the activity of the DNMT enzyme and thereby inhibits DNA methylation that might cause CRC. In addition to 5-AZA, another chemotherapeutic drug named 5-fluorouracil (5-FU) was applied either synergistically with 5-AZA, or alone, in this study. Both drugs were applied to the human colorectal carcinoma cell line, HCT116, by performing several methods, such as MTT assay, wound healing assay, and colony formation assay to assess the cells viability and migration property before and after treatment to analyse their effect on CRC. In addition, whole exome sequencing (WES) was performed to assess the genetic changes after treatment with 5-FU. HEK293, which is the human embryonic kidney cell line, was used in the study as the control cell line receiving the same treatment regime as the HCT116 cells. The main result of this study shows that both drugs have a noticeable effect on the viability of HCT116 cells. 5-AZA alone possesses the highest efficacy on HCT116 cells, followed by the drugs combination and 5-FU alone, respectively. In addition, WES results show that 5-FU diminished the number of mutations in HCT116 cells. In a conclusion, 5-AZA alone as a treatment plan for CRC has more efficacy than either 5-FU alone or the drugs combination which leads to the recommendation of using it alone as an anticancer drug. Also, WES results suggest that the 5-FU mechanism of action as a DNA damage drug is proven.يعيش الناس في الوقت الحاضر عصر يتمتع بمعايير عالية من إمكانية الوصول إلى الرعاية الصحية، والتي يمكن أن تحسن بشكل ملحوظ أدوات التشخيص وخطط العلاج للأمراض المختلفة. تساهم هذه المعايير في تحديد متوسط العمر المتوقع العام في أجزاء كثيرة من العالم. لكن مع مرض السرطان، ارتفع معدل الوفيات على مستوى العالم بنحو 40٪ خلال العقود الأربعة الماضية، ومن المتوقع أن تزداد الوفيات بشكل أكبر لتصل إلى 60٪ في العقد الحالي مع وفاة تقديرية بـ 13 مليون مريض بالسرطان بحلول عام 2030. يعتبر سرطان القولون والمستقيم ثالث أكثر أنواع السرطانات شيوعًا وثاني سبب رئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان لكلا الجنسين في العالم. قد يكون تفسير زيادة معدل الوفيات بسرطان القولون والمستقيم ناتجاً عن بعض العوامل البيئية؛ كالتدخين، والنظام الغذائي السيئ، والسمنة، وقلة النشاط البدني، بالإضافة إلى الخلفية الوراثية. تشمل المسارات الرئيسية لأسباب الإصابة بسرطان القولون والمستقيم، سواءً العوامل البيئية (الإبيجينية) منها أو الجينية، فرط مثيلة ثنائي النيوكليتيدات (سايتوسين) و (جوانين) أو عدم استقرار السواتل الدقيقة لنقص الجين الخاص بإصلاح عدم تطابق القواعد النيتروجينية للنيوكليتيدات. بالنظر إلى أن سرطان القوقلون والمستقيم يمثل 10٪ من أكثر أنواع السرطان التي يتم تشخيصها شيوعاً، فهناك حاجة ملحة لتطوير خطط علاج فعالة لمرضى هذا السرطان. 5-أزاسيتيدين، وهو نظير للنيوكليوسايد سيتيدين بيريميدين، عبارة عن دواء إبيجيني يندمج في الحمض النووي ويمنع نشاط إنزيم يسمى (دي إن إم تي) وبالتالي يمنع مثيلة الحمض النووي التي قد تسبب الإصابة بسرطان القولون والمستقيم. تم تطبيق 5-أزاسيتيدين في هذه الدراسة إما بمفرده أو بالتآزر مع 5-فلورويوراسيل، وهو نظير آخر للنيوكليوسايد سيتيدين بيريميدين، حيث تم تطبيق 5-فلورويوراسيل بمفرده أيضاً على خط خلايا سرطان القولون والمستقيم البشري (إتش سي تي 116) وتمت دراسة خصائص هذه الأدوية وملاحظة تأثيرها على خط الخلايا المذكور من خلال تنفيذ عدة تقنيات مخبرية مثل: تقنية (إم تي تي) وهو اختبار قياس لوني لتقييم نشاط الخلايا الاستقلابي بعد إضافة الأدوية المذكورة، وتقنية فحص الهجرة الخليوية، وتقنية مقايسة القابلية لتكوين مستعمرات خليوية. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تقنية التسلسل الكامل لإكسومات خلايا القولون والمستقيم (إتش سي تي 116) بعد علاجها باستخدام 5-فلورويوراسيل لغرض تقييم التغيرات الجينية. تم استخدام خلايا (إتش إي كيه 293)، وهو خط خلايا الكلى الجنينية البشرية، في الدراسة كخط خلايا تحكم تتلقى نفس الخطة العلاجية لخلايا (إتش سي تي 116). تظهر النتيجة الرئيسية لهذه الدراسة أن كلا العقارين لهما تأثير ملحوظ على قابلية خلايا (إتش سي تي 116) للحياة. حيث يمتلك 5-أزاسيتيدين بمفرده أعلى أعلى فعالية على خلايا (إتش سي تي 116)، يليه مزيج الأدوية ثم 5-فلورويوراسيل بمفرده. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت نتائج التسلسل الكامل لإكسومات خلايا (إتش سي تي 116) أن 5-فلورويوراسيل قلل من عدد الطفرات الجينية في خلايا (إتش سي تي 116). في الختام، يعد 5-أزاسيتيدين بمفرده كخطة علاج لسرطان القولون والمستقيم ذو فعالية أكثر من مزيج الأدوية أو 5-فلورويوراسيل بمفرده، مما يؤدي إلى التوصية باستخدامه وحده كدواء مضاد لسرطان القولون والمستقيم في الأبحاث المستقبيلة. أيضاً، تثبت نتائج تسلسل الإكسومات الكامل نجاح آلية عمل دواء 5-فلورويوراسيل في إتلاف الحمض النووي لخلايا (إتش سي تي 116).