كشف وتوصيف أنواع الكامبيلوباكتر والفاجات التى تصيبها من لحوم الدجاج التي تباع بالتجزئة في مدينة جازان، المملكة العربية السعودية
Abstract
يعتبر ميكروب الكامبيلوباكتر (العطيفة) هو العامل المسبب لمرض كامبيلوباكتيريوسيس الذي يصيب الإنسان وينتقل عن طريق الغذاء، وهذا المرض هو أحد أكثر أشكال التهاب المعدة والأمعاء البكتيري شيوعًا في جميع أنحاء العالم. يعتبر الجهاز الهضمي للطيور وغيرها من الحيوانات الأليفة هو المستودع الطبيعي لبكتيريا العطيفة كجزء من الميكروبات الطبيعية الموجودة في الجهاز الهضمي. وكذلك تعتبر لحوم الدواجن هي المصدر الرئيسي للعدوى بمرض كامبيلوباكتيريوسيس بين الأطعمة المختلفة.
في هذه الدراسة ، تم جمع ستة وثمانين عينة من لحوم وأعضاء الدجاج (اللحوم: الأفخاذ = 21 ، الصدور = 16 ، الأرجل = 21 ، الأجنحة = 17 ، الأعضاء: الكبد = 11) من السوبر ماركت ومحلات البيع بالتجزئة في مدينة جازان. ومثلت العينات المجمعة سبع علامات تجارية شائعة لشركات الدواجن في مدينة جازان وتم الإشارة إليها الأحرف: A، B ، C ، D ، E ، F & G.
تم فحص وفقًا للبروتوكول: (ISO 10272-1/2017) ، باستخدام مرق بولتون الانتقائي (Bolton Selective Enrichment Broth) الذي يحتوي على 5 ٪ من الدم المتحلل ومضادات ميكروبية (Cefoperazone, Vancomycin, Trimethoprim & Cycloheximide)، والأجار الانتقائي mCCDA (Modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar) الذي يحتوي أيضا على مضادات ميكروبية (Amphotericin B & Cefoperazone) تسمح فقط بنمو ميكروب الكامبيلوباكتر. تمت عملية الفحص عن طريق وزن عشرة جرامات من كل عينة من عينات الدجاج في كيس بلاستيكي معقم ، ثم إضافة 90 مل من مرق بولتون الانتقائي المعقم وتم خلطها جيدا باستخدام جهاز الخلط (Stomacher). بعد ذلك تم تحضين الخليط عند حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ، بعد ذلك تم التحضين عند درجة حرارة 41.5 درجة مئوية لمدة 44 ساعة تحت ظروف بيئية منخفضة الاكسيجين (5% O2, 10% CO2, and 85% N2). بعد التخضين، تم فرد 0.1 ملليتر من المرق على أجار mCCDA المعدل، وتم تحضين الأطباق عند 41.5 درجة مئوية لمدة 48 ساعة تحت نفس الظروف البيئية المناسبة لنمو ميكروب الكامبيلوباكتر.
من بين 86 عينة (تمثل 7 شركات) ، أظهرت 61 نموًا على أطباق أجار mCCDA بعد التحضين. في المقابل، لم يلاحظ أي نمو جرثومي على لوحات أجار mCCDA من عينات تمثل إحدى الشركات السبع (الشركة B). بعد ذلك تم فحص جميع العزلات البكتيرية (العدد = 122) بطريقة تفاعل تسلسل البلمرة المتعدد لميكروب الكامبيلوباكتر (Campylobacter Multiplex-PCR) لتحديد جنس Campylobacter (816 bp) وتحديد أنواع العطيفة الثلاثة: C. jejuni (323 bp) ، C. Coli (126 bp) ، و C. lari (251 bp). أظهر تفاعل تسلسل البلمرة المتعدد لأنواع العطيفة نتائج إيجابية فقط من بكتيريا الكامبيلوباكتر المعرفة ولكن ليس من العزلات البكتيرية. وبالتالي ، تم تحديد العزلات على أنها ليست كامبيلوباكتر بكتيريا. لتأكيد هذه النتيجة ، تم إختيار 19 عزلة بكتيرية وعمل تفاعل تسلسل البلمرة (PCR) لجين الحمض الريبوزي الريبوسومي (16S-rRNA gene). أظهر تحليل تسلسل الحمض النووي على موقع NCBI أن ستة عشر عزلة (84٪) تم تعريفها على أنها E. coli وثلاث عزلات (16٪) على أنها Proteus mirabilis وهي غير حساسة للعديد من المضادات الحيوية وتتسب أمراض للإنسان وبخاصة عدوى الجهاز البولي. علاوة على ذلك ، تم إختيار ستة عزلات بكتيرية (من العزلات التي تم معرفة تتابع الحمض النووي لهم وتم تعريفهم) وعمل إختبار الحساسية للمضادات الحيوية لهم باستخدام 8 مضادات حيوية: (Amoxycillin (AMX) ، Azithromycin (AZM) ، Chloramphenicol (C) ، Erythromycin (E) ، Tetracycline (TE) ، Nalidixic acid (NA) ، النورفلوكساسين (NX) واستربتومايسين (S)، وأظهرت النتائج أن جميع العزلات كان لديها مقاومة متعددة للمضادات الحيوية، وهذا يفسر نموها على الأوساط البيئية المستخدمة لنمو وعزل ميكروب الكامبيلوباكتر والتي تحتوي على مضادات حيوية. وأخيراً تم اختبار 24 عينة ضد 3 سلالات معرفة من بكتيريا الكامبيلوباكتر (C. jejuni ATCC 33291, C. coli ATCC 33559 & C. lari ATCC 35221) كمضيفات حساسة لاكتشاف لاقمات العطيفة المحللة باستخدام اختبار البقعة. لم يتم ملاحظة أي مناطق تحلل من السلالات المعرفة الثلاثة المختبرة ضد جميع المرشحات الـ 24 ، أي أنه لم يتم اكتشاف عاثيات كامبيلوباكتر في العينات.
مستقبلا سوف يتم تعريف باقي العزلات البكترية بإستخدام تفاعل تسلسل البلمرة (PCR) لجين الحمض الريبوزي الريبوسومي (16S-rRNA gene) وتحليل تتابع الحمض النووي له، وكذلك عمل إختبار الحساسية للمضادات الحيوية لجميع العزلات البكتيرية باستخدام عدد أكبر من المضادات الحيوية.
Description
campylobacter spp. is the causative agent of the human foodborne disease
Campylobacteriosis, one of the most common forms of bacterial
gastroenteritis worldwide. The digestive system of birds and other domestic
and free-living animals is the natural reservoir of Campylobacter bacteria as a
part of normal flora. Thus, Poultry meats have been considered the primary
source of campylobacteriosis infections among various foods.
In this study, eighty-six samples of chicken meat and organs (Meat: thighs =
21, breasts = 16, legs = 21, wings =17, and Organs: liver = 11) were collected
from supermarkets and retail shops in Jazan City. Collected samples
represented seven common commercial brands of poultry companies (A, B, C,
D, E, F, & G) in Jazan City.
Cultivation and isolation of Campylobacter spp. were carried out according to
the protocols described by ISO 10272-1: 2017 using sterile Bolton Selective
Enrichment Broth (containing 5% lysed blood and antibiotics supplement) and
modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar (mCCDA) having
CCDA antibiotics supplement. Ten grams of chicken meat sample were
weighed into a sterile plastic bag, then 90 ml sterile Bolton Selective
Enrichment Broth was added and homogenized using a Stomacher. Finally, the
mixture was incubated at 37 °C for 4 hours, followed by 41.5°C for 44+ 4
hours under microaerophilic conditions (5% O2, 10% CO2, and 85% N2).
After enrichment, 0.1 ml of the broth was streaked onto campylobacter
selective agar (mCCDA). The plates were incubated at 41.5ºC for 48 hours
under the same microaerophilic conditions.
Out of the 86 samples, 61 (representing six companies) showed growth on
mCCDA agar plates after incubation. In contrast, no bacterial growth was
observed on mCCDA agar plates from samples representing one of the seven
companies (Company B). Bacterial isolates (n = 122) were subjected to a
Campylobacter multiplex Polymerase Chain Reaction (Multiplex-PCR) for the
identification of the genus Campylobacter (816 bp) and identification of the
three campylobacter species; C. jejuni (323 bp), C. Coli (126 bp), and C. lari
Master thesis Eklas Sawadi
(251 bp). PCR products for the Campylobacter species were obtained only
from the positive controls but not the isolates; consequently, the isolates were
identified as non-Campylobacter species. To confirm this result, 19 isolates
were identified by amplifying and sequencing the 16S rRNA gene. Sequence
analysis on the NCBI website showed that sixteen isolates (84%) were
identified as E. coli and three isolates (16%) as Proteus mirabilis. Furthermore,
six of the sequenced isolates were subjected to an antibiotic susceptibility test
using 8 antibiotics: (Amoxycillin (AMX), Azithromycin (AZM),
Chloramphenicol (C), Erythromycin (E), Tetracycline (TE), Nalidixic acid
(NA), Norfloxacin (NX), and Streptomycin (S). Results showed that all
isolates were multidrug resistant. Finally, 24 filtrate samples were tested
against the 3 Campylobacter reference strains (C. jejuni ATCC 33291, C. coli
ATCC 33559 & C. lari ATCC 35221) were used as sensitive hosts for the
detection of lytic Campylobacter phages using spot-test. No lysis zones were
observed from the three tested reference strains against all 24 filtrates, i.e., no
lytic Campylobacter phages were detected in the filtrates.
In the future, the rest of the bacterial isolates will be identified using
polymerase chain reaction (PCR) for the 16S-rRNA gene and analyzing its
DNA sequence, as well as antibiotic sensitivity testing for all bacterial isolates
using a more significant number of antibiotics.
Keywords
أنواع الكامبيلوباكتر