Synthetic Bioarchitecture Comprised of S-layer Proteins, Lipid Membranes, and in vitro Synthesized Membrane Proteins
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Date
2013
Authors
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Publisher
Saudi Digital Library
Abstract
Membranproteine spielen eine entscheidende Rolle in den Funktionszusammenhängen lebender Zellen. Aufgrund der Komplexität zellulärer Membranen gibt es ein wachsendes Interesse künstliche biomimetische Membranarchitekturen zu entwickeln, die eine reproduzierbare Untersuchung funktioneller (Trans)Membranproteine ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei unterschiedliche Modelllipidmembranen erzeugt und charakterisiert. In der etablierten S-Schicht-Lipid Membran (SsLM) wurden Struktur- und Funktionseigenschaften von einem eingebauten Peptid (Gramicidin) und rekonstituierten Proteinen (spannungsabhängiger Anionenkanal (VDAC), α-Hämolysin) mittels der Methode der Quarzkristallmikrowaage untersucht. Der Einfluss des Strukturaufbaus auf die Dissipation wurde gleichzeitig mit der Veränderung der Impedanz gemessen. Ein wichtiges Resultat dieser Arbeit ist, dass das SsLM Modell eine vielversprechende Plattform für die Untersuchung membranaktiver Peptide und Membranproteine darstellt. Allerdings blieb der Versuch α-Hämolysin funktionell in SsLMs nachzuweisen ohne Erfolg, während sich Gramicidin und VDAC in ihrer Funktion nachweisen ließen. Daraus kann auf die Vielzahl der Parameter geschlossen werden, die für den erfolgreichen Einbau von Membranproteinen, ihre Organisation in Substrukturen und ihre korrekte Assemblierung verantwortlich sind. Ein weiterer wichtiger Aspekt dieser Arbeit besteht in der Anwendung einer neuen Strategie zur Untersuchung vom VDAC basierend auf einem bottom up Ansatz, der direkt von der kodierenden DNA Sequenz ausgeht und in dem fertig rekonstituierten Membranprotein mündet. Diese Strategie wurde dahingehend angewendet, dass auch die optimale cDNA Sequenz generiert wurde, um einen möglichst effektiven, zellfreien Syntheseansatz zu erhalten. Zielstrukturen waren verschiedene Membranmodelle, wie die SsLM Struktur und Lipidvesikel. Zusammenfassend ist in dieser Arbeit der Nachweis geführt worden, dass die Kombination des SsLM Modells mit der zellfreien (in vitro) Synthesestrategie einen vielversprechenden Ansatz zur Untersuchung von Membranproteinen bildet – sowohl für Fragen der Grundlagenforschung, als auch für angewandte Fragestellungen im Bereich der Nanobiotechnologie und der synthetischen Biologie.
Description
Membrane proteins play a pivotal role for the functioning of biological systems. As biological membranes exhibit a considerable structural and functional complexity, there is growing interest in the development of biomimetic membrane architectures. These model lipid membranes have to be designed in a way that reproducible investigations on functional (trans)membrane proteins become feasible. In the present thesis, peptide-tethered and S-layer protein supported lipid membranes (SsLMs) were generated and characterized. Referring to successful generation of an SsLM, the reconstitution of the pore/channel forming gramicidin, α-hemolysin and voltage-dependent anion channel (VDAC) were elaborately investigated by quartz crystal microbalance with dissipation monitoring in combination with electrochemical impedance spectroscopy. The obtained results indicate that S-layers act as stabilizing matrix preserving fluidity of lipid membranes and hence, constitute promising scaffolding for model membranes. Indeed, S-layers are a good alternate to other conventional supports. Most important, SsLM represents a promising platform to investigate membrane-active peptides and membrane proteins. However, despite functional incorporation of gramicidin and reconstitution of VDAC into SsLMs, no reconstitution could be achieved for α-hemolysin which reveals some limitations for this architecture. Accordingly, functional reconstitution of membrane proteins might be governed by many factors such as the shape of pores/channels and the number of subunits necessary for correct assembly. Moreover, this study employs a novel strategy for VDAC based on a bottom up approach starting from a DNA sequence and ending with a functional channel reconstituted into this biomimetic environment. The strategy consists of finding the optimal genetic sequence to fulfill the requirement of the cell-free VDAC synthesis and the subsequent reconstitution of the produced channel protein into different architectures like solid supported lipid membranes or lipid vesicles. In summary, the present thesis work provides strong evidence that combining SsLM with cell free protein expression system constitutes a prospective approach for enhancing basic and applied research in the field of nanobiotechnology and synthetic biology