Molecular cloning and expression in Escherichia coli of a serine protease inhibitor gene from Rhamnus Frangula L
Date
2024-04-25
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Qassim University
Abstract
مثبطات البروتياز هي عبارة عن بروتينات موجودة في الإنسان ومعظم الكائنات الحية كالنباتات والحيوانات ووظيفتها تنظيم نشاط التحلل البروتيني، ومن أكثر المثبطات التي حظيت بالاهتمام لتطبيقاتها المتعددة في التكنولوجيا الحيوية والطب الحيوي هي مثبطات السيرين بروتياز والتي تعد من أبرز المثبطات في النبات. هدفت الدراسة إلى تضخيم واستنساخ جين مثبط سيرين البروتياز من نبات (Rhamnus frangula). تم تصميم البادئات بالاستناد على الأحماض الأمينية لمثبط كونيتز التربسين ۳ الموجود في فول الصويا (Glycine max) واستخدامها لتضخيم تسلسل جين الـ(RfIP1) من (DNAو RNA) المستخرجة من أوراق (Rhamnus frangula) باستخدام (PCR وPCRـRT)، اظهر الفصل الكهربائي اختلافًا في هجرة امبليكون من DNAوcDNA مما يكشف وجود متوالية داخلية مكونة من ٢١٠ نكليوتيدة. أظهرت نتيجة PCRـRT أن تسلسل cDNA يحتوي على إطار مفتوح يبلغ ٥٧٠ زوج قاعدي والذي يشفر ١٩١حمض أميني. بواسطة الـBLAST في قواعد بيانات NCBI كشف أن تسلسل cDNA يشترك بنسبة ٧٢.٦٩٪ مع مثبط كونيتز التربسين ۳ الموجود في فول الصويا (Glycine max) و١٢ .٦٩٪ مع مثبط كونيتز التربسين ۳(Glycine soya) مما يشير إلى أن هذا الأنواع قد تنتمي إلى نفس التركيب البروتيني والوظيفي.
في الختام، نجحنا في تصنيع cDNA لمثبط سيرين البروتياز نوع كونيتز من نبات (Rhamnus frangula) واستنساخه جزيئًا في E. coli. تم أيضًا هندسة التراكيب الثانوية وثلاثية الأبعاد للمثبط باستخدام برنامج(I-Tasser). كما تم إجراء تحليل التطور الوراثي باستخدام برنامج التحليل الوراثي التطوري الجزيئي. بعد حصولنا على هذه النتائج يمكننا إضافة (RfIP1) إلى قائمة مثبطات البروتياز المستخلصة من النباتات والتي ستثرى لما لها من تطبيقات تكنولوجية حيوية وعلاجية مهمة.
Description
Protease inhibitors are proteins found in plants, animals, humans, and microorganisms, and they serve to regulate proteolytic activity. Serine protease inhibitors have received significant attention for their numerous applications in biotechnology and biomedicine, and they are the most prominent inhibitors found in plants. The study aimed to amplify and clone the serine protease inhibitor gene from Rhamnus frangula L. Using the amino acid information of trypsin inhibitor of Kunitz trypsin inhibitor 3 Glycine max (soybean), degenerate primers were designed. From the leaves DNA and RNA, a full length cDNA sequence was amplified, named RfIP1 (Rhamnus frangula Protease Inhibitor 1) using PCR and RT-PCR respectively. Electrophoresis analysis revealed the existence of an intron of 210 nucleotides, and a difference in the amplicon's migration obtained on DNA and cDNA. The result of the RT-PCR confirmed that the cDNA sequence contained an open reading frame (ORF) of 570 bp, which translated to 191 amino acid residues. The sequence analysis by BLAST in the NCBI databases showed high similarity scores revealing that the RflP1 sequence shares identity rates of 72.69% with Kunitz trypsin inhibitor 3 (Glycine max) and 69.12% with Kunitz trypsin inhibitor (Glycine Soya), suggesting that these species may belong to the same category. In conclusion, we successfully synthesized the cDNA of serine protease inhibitor of the Kunitz-type from the plant Rhamnus frangula L. We manufactured and cloned it in a prokaryotic system using E. coli. The secondary and three-dimensional structures of the inhibitor were also predicted with iterative threading assembly refinement (I-Tasser) software. Phylogenetic analysis was carried out using Molecular Evolutionary Genetic Analysis software. The RflP1 add to the Bank of plant protease inhibitors suggest important biotechnological and therapeutic applications.
Keywords
Rhamnus frangula proteas e inhibitor, Molecular cloning, 3D structure, Bioinformatic., مثبط البروتياز Rhamnus frangula, المعلوماتية الحيوية, تركيب ثلاثي الأبعاد, الاستنساخ الجزيئي